实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR

定义

荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，SYBR Green I只有与双链DNA结合才能发出荧光，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加，荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。以SYBR Green I作为检测信号的荧光定量PCR方法称为染料法。

一般实验过程

1）样品RNA的抽提

2）样品RNA质量检测

3）样品cDNA合成

4） 待测样品的待测基因实时定量PCR

5） 电泳检测

如需进行绝对定量RT-PCR，还需制备相应标准品，绘制标准曲线。

样品要求

1、客户提供总RNA或新鲜/冷冻的组织或细胞。须保证：

1）总RNA无明显降解，总量大于5 mg。如果基因丰度较低或调取的基因较长，为了保证实验顺利，请您提供尽量多的材料。

2）实验材料必须保证新鲜，请您采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂(如Sample Protector)；

2、请提供目的基因信息。

3、请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA、来源、丰度等。选择合适的时间取样对获得理想的实验结果起着决定性的作用，真核生物基因表达高峰期一般在蛋白理化指标高峰期的前一阶段，请适时选取。

服务内容

1、根据基因序列设计目的基因以及内参基因的引物

2、提取总RNA，通过OD260/280值测定对RNA样本进行定量。

3、将RNA逆转录为cDNA。

4、普通PCR扩增内参基因，以确保逆转录成功。

5、Real-Time PCR(荧光定量PCR)，进行实验结果分析 。

6、实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。

终产品

1、完整的实验报告（实验仪器，实验步骤等）；

2、原始实验数据，软件分析的实验结果，扩增曲线和溶解曲线；

3、交付剩余的实验材料（样品，总RNA，cDNA，引物等）。