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免疫荧光

发表时间:2019-05-09 17:06

免疫荧光(双标或单标)


定义


将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。免疫荧光检测可分为直接法、间接法、夹心法和补体法。


一般试验方法


1、直接法


将标记的特异性荧光抗体,直接加在抗原标本上,经一定的温度和时间的染色,用水洗去未参加反应的多余荧光抗体,室温下干燥后封片、镜检。


直接法一般实验步骤:


1) 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。


2) 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。


3)取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。


4)取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。


5)立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:


(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。


2、间接法


如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗原—抗体—抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为第一抗体,其它步骤的抗原检查相同。


原理如图所示:


间接法一般实验步骤:


1)滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原标本片,10min后弃去,使标本片保持一定湿度。


2)滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本,覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。


3)取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗1-2次,然后按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不时振荡。


4)取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。


5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。


6)重复操作3。


7)取出玻片,用滤纸吸去多余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。


8)荧光显微镜高倍视野下观察,结果判定同直接法。


服务内容


提供免疫荧光染色服务,并对染色后结果进行显微照相。

样品要求


1、石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片。

2、目的蛋白一抗。



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