克隆形成

原理

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。目前主要有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成两种方法。

基本步骤

1、平板克隆形成试验

1）取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞密度至1×106细胞/L，将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置细胞培养箱中培养2～3周。

2）经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

3）将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。计算克隆形成率。

2、软琼脂糖克隆形成试验

1)取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞密度至1×106细胞/L，根据实验要求作梯度倍数稀释。

2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃防止凝固。

3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×培养基混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中，冷却凝固，作底层琼脂置CO2温箱中备用。

4)按1:1比例使0.7%的琼脂糖和2×培养基混合后，向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，培养10～14天。

5)观察细胞克隆数，计算克隆形成率。

客户须知

1、客户需提供生长状态良好的实验细胞及细胞培养条件；

2、客户需准确告知实验设计内容，如样本浓度等，并提供实验所需因子等；

3、其客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。

终产品

1、克隆形成实验检测原始数据、图片；

2、全套详细实验报告，包括实验流程、材料方法、实验结果等。