流式细胞凋亡检测

流式细胞凋亡检测

定义

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

特点：一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从 群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。

流式细胞术检测样品推荐制备方法：

1、直接标记抗体（FITC标记抗体）：

1）收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。

2）用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。

3）用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。

4）用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

2、未标记抗体间接免疫荧光标记法：

1）收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。

2）用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min，800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；

3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。

4）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min，800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。

5）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。

6）加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。

7）流式细胞仪检测荧光值，每管计数10 000个细胞。

3、 细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析(PI染色)用样品的制备：

1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。

2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。

3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。

4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。

客户提供

1、需提前预约，样本要求为单细胞悬液或外周血，并请提供样本来源及处理方法等信息，同时说明实验目的、方法等；

2、荧光探针和抗体等由用户提供，也可委托我公司代购，用户所提供抗体应可与样本发生特异性识别反应。

终产品

提供细胞凋亡检测试验报告