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实时荧光定量PCR技术

发表时间:2019-05-09 16:50

荧光定量PCR



定义


荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。



SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料,SYBR Green I只有与双链DNA结合才能发出荧光,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,荧光信号与双链DNA分子数成正比,随着扩增产物增加而增加,荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。以SYBR Green I作为检测信号的荧光定量PCR方法称为染料法。



一般实验过程


1)样品RNA的抽提


2)样品RNA质量检测


3)样品cDNA合成


4) 待测样品的待测基因实时定量PCR


5) 电泳检测


如需进行绝对定量RT-PCR,还需制备相应标准品,绘制标准曲线。



样品要求


1、客户提供总RNA或新鲜/冷冻的组织或细胞。须保证:


1)总RNA无明显降解,总量大于5 mg。如果基因丰度较低或调取的基因较长,为了保证实验顺利,请您提供尽量多的材料。


2)实验材料必须保证新鲜,请您采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂(如Sample Protector);

2、请提供目的基因信息。

3、请提供尽可能详细的背景资料:DNA/RNA、来源、丰度等。选择合适的时间取样对获得理想的实验结果起着决定性的作用,真核生物基因表达高峰期一般在蛋白理化指标高峰期的前一阶段,请适时选取。




服务内容


1、根据基因序列设计目的基因以及内参基因的引物

2、提取总RNA,通过OD260/280值测定对RNA样本进行定量。


3、将RNA逆转录为cDNA。


4、普通PCR扩增内参基因,以确保逆转录成功。


5、Real-Time PCR(荧光定量PCR),进行实验结果分析 。

6、实验完成后,提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验材料。



终产品


1、完整的实验报告(实验仪器,实验步骤等);


2、原始实验数据,软件分析的实验结果,扩增曲线和溶解曲线;


3、交付剩余的实验材料(样品,总RNA,cDNA,引物等)。


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